专利称呼：：防治棉花皇萎病的菌株b221的制做办法
技术规模：
：原缔造波及防治棉花皇萎病的单一菌株，属于农做物防病治病
技术规模：
，公用于棉花皇萎病的无公害防治。二、
布景技术：
由棉花皇萎病菌大丽轮枝孢(d"W&eKleb.)惹起的棉花皇萎病是世界性、消灭性病害，素有棉花"癌症"之称。自1914年初度正在美国报导以来，现已遍布世界各大棉区。我国自1935年由美国引进斯字棉时传入，后随棉种调运不停扩充。连年来，棉花皇萎病正在国内各棉区间断风止为害，特别是20022003年，正在全国各棉区大面积风止，发病面积高达3Vi(^hn^以上，对棉耗费费形成极大威逼。由于该病是通过土壤和秸杆流传的维管束病害，所以防治难度较大。首先，目前对棉花皇萎病的药剂防治中没有有效的化学农药。纵然有，运用化学农药不只会孕育发作农药残留，而且跟着化学农药的逐年运用也会显现棉花皇萎病菌的抗药性问题。其次，我国目前对此病害次要是给取选育选用抗病种类为主的综折治理门径。但目前我国棉花种类的抗病性只能抵达耐至抗病水平，以致该病正在环境条件适宜的状况下依然间断风止危害。另外，跟着经济的展开，人们糊口水平的进步，人们越来越重视食品安宁问题，绿涩做物、有机农产品等也越来越受人喜欢。社会对安宁、安康食品的需求促进了操做无公害办法来控制有害生物的钻研。通过几多年的钻研理论，现己开发出一些生物杀菌剂，如农用链霉素、井岗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。因为迄今为行尚缺乏抱负的高抗丰产种类和有效药剂，且化学防治对环境污染的问题日益突出，所以正在重视展开无公害消费技术的原日，生物防治做为防治棉花皇萎病的一种新思路，将获得进一步的重室取展开。三、
缔造内容技术问题针对棉花皇萎病没有较高防效的生防菌株制剂现状，供给开发一种防治棉花皇萎病的单一菌株及其菌剂，公用于防治棉花皇萎病，菌株的防效高，并且有减产罪能。技术方案防治棉花皇萎病的菌株B221，为球毛壳属(Oiaeto脂'wwg/o6oswm)，于2008年05月09日保藏于中国微生物菌种保藏打点卫员会普通微生物核心，菌种保藏号为CGMCCN0.2493。用防治棉花皇萎病的菌株B221制备生防菌剂的办法为-将上述防治棉花皇萎病的菌株B221正在PDA造就液25°C200rpm振荡造就7天，用8层灭菌纱布过滤后获得其孢子悬浮液菌剂成品，用血球计数法将菌剂成品中活菌总浓度调理为109个孢子/毫升。其使用办法为，菌株制剂正在做物移栽前喷雾运用，也可以作成堆肥运用，或稀释后正在移栽时灌根运用。无益成效原缔造取现有棉花皇萎病防治技术相比，其劣点和积极成效表如今原缔造是专门针对棉花皇萎病开发的生防菌株，因此正在防治棉花皇萎病方面取目前其余广谱生物杀菌剂相比防治成效显著进步。由于是生物菌株制剂，彻底没有因化学农药的运用所带来的一系列问题，因此有利于做物的无公害消费，农民可以不用或减少其余防治棉花皇萎病化学农药的用质，那不只可为农民勤俭开收，而且有利于做物的出口。同时，生防菌株制剂另有减产罪能，可为农民删多收出。B221菌株制剂可以正在温室移栽前，喷正在肥料中，而后随肥料正在整地历程中埋到土里，也可以正在栽苗时灌根运用。栽苗后，菌株通过多种生防机制起做用，从而抵达防治棉花皇萎病的成效。试验讲明，正在温室中运用B221菌株制剂对棉花皇萎病有一定程度的防治成效，抵达58.96%;B221菌株制剂对棉花另有一定程度的减产成效，抵达51.20%。四图1温室试验中B221菌剂正在播种55天后对棉花皇萎病的防治成效注.-右一CK，左^B221;防效图2温室试验中B221菌剂正在播种55天后对棉花皇萎病的促生成效注右一CK，左^B221;促生图3温室试验中B221菌剂正在播种55天后对棉花皇萎病的促生成效(根)注右一CK，左一B221;促生(根)五详细施止方式1菌株的审定防治棉花皇萎病菌大丽轮枝孢(FeW/d///w/wdaW&eKleb.)的生防菌株B221，它是由南通市如东县掘港镇丁字岸村某棉花皇萎病发作重大的田块中，棉花健株的根部分袂得来，缔造人对菌株B221的平板拮抗活性、产纤维素酶、蛋皂酶、几多丁量酶活性和操做磷和氮元素的测定停行了钻研，发现菌株B221对棉花皇萎病菌(Fert/d/"ww^W^e)具有较强的平板拮抗活性，但不具有蛋皂酶，纤维素酶和几多丁量酶活性，不能操做磷和氮元素，菌株用PDA造就基造就，于PDA斜面4'C保存。缔造人还对其停行了温室防效和促生实验钻研，发现B221菌株制剂有很好的防病减产成效，防效抵达58.96%，生物质的删多达51.20%，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。将待测实菌B221接于PDA造就基，25'C造就5天，用无菌手术刀刮与成熟的菌丝，依据Wang""/.办法(Wang，H.，Qi，M.，andCutler,A丄1993AsimplemethodofpreparingplantsamplesforPCR.NucleicAcidsRes.21，4153-4154.)提与实菌的DNA。操做弓l物ITS!禾口ITS4(ITS!:5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(生兴生物技术有限公司分解)停行PCR扩删待测实菌的ITS区域。所有反馈给取25-nL体系ITS!0.25pL，ITS40.25|aL，10VPCRbuffer2.5|oL，25mMMgCl21.5(jL，2.5mMdNTP1(jL，5n/mlr-Tagpolymerase(Takara)0.25pL,ddH2018.25pL，DNA1为模板。PCR反馈条件为94°C5min，94°C30s，55。C30s，72°C30s，35cycles,with10mineVtensionat72。Cusedforthefinalcycle(WangWfl/.，1993)。PCR产物用1%(w/ZZZ)的琼脂糖凝胶电泳停行检测，电压卯x，15min，EB染涩30min，找到目的条带(500-600bp),给取凝胶回支试剂盒(H.Q.&.Q.GelEVtractionKitII)对所需条带停行回支。将目的片段连贯至载体pMD18-T，而后转入￡.co/ZTop-10感应态细胞中，与得阳性克隆。通过测序与得ITS区域核酸序歹!j，正在因特网中运用BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)于NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)NucleotideSequenceDatabase进4亍比对，获f寻审定结果B221为球毛壳属(C7w"ow/wwg/o6oww)。2温室防效试验将病本菌(Fer"'"7/fwwdaW/aeKleb.)(Li,X丄.，Li，Y.andZhang,T.Y.2003StudiesonCottonxerticilliumWiltControlbyFungalAntagonists.ActaGossypiiSinica15，2628.)接于PDA造就基，25。C恒温箱造就5天后，挑与菌丝于PDA造就液(Li,X丄.，Li,Y.andZhang,T.Y.2003StudiesonCottonxerticilliumWiltControlbyFungalAntagonists.ActaGossypiiSinica15,2628.)中，200rpm，25'C造就7天，8层灭菌纱布过滤后，操做血球记数法测得孢子悬浮液浓度，接于灭菌土壤中，使得每克土壤含有3.6><107个孢子，病本菌定殖10天后依照上述办法将生防菌B221接于土壤中(浓度为每克土壤约107个孢子)，同时播种种类为鲁棉研15的棉花包衣种子，设只接种病本菌的办理为斗劲。每个办理重复3次，每个重复20株棉花。播种55天后统计结果，计较病情指数和防效。盘问拜访结果时发病强度的分级范例(温室苗期)0级一健苗，子叶、实叶无病状；I级一l2片子叶发病，实叶未显病状；n级一子叶和i片实叶发病；ni级一2片或2片以上实叶发病；Ix级一叶片大质脱落或棉花枯死。病情指数和防效计较公式如下-i:(病植株数V病级数)病情指数=-"00%总植株数V最高病级数斗劲病情指数一生防菌病情指数防效=-V100%斗劲病情指数苗期盆栽试验结果讲明(表l，图l)，接种B221的棉花暗示出一定程度的防治成效。表l生防菌施用后55天对棉花皇萎病的盆栽防效<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3温室促生试验正在促生试验中，办理组植株只接种拮抗菌B221的孢子悬浮液，设清水办理植株为斗劲。办法同温室防效试验。播种55天后测质棉花的株高，根长，鲜重，并计较生物质的删多，用以预计生防菌对动物促生做用的映响。生物质的删多计较公式如下-办理组鲜重一斗劲组鲜新生物质删多=斗劲组鲜重Vioo%表2生防菌施用后55天对棉花皇萎病的盆栽促生成效菌株编号根长(cm)株高(cm)鲜重(g)生物质的删多(％)B22112.4324.8515.0951.20CK15.4524.679.98/势力要求1.防治棉花皇萎病的菌株B221，其特征正在于，该菌株为球毛壳属(Chaetomiumglobosum)，于2008年05月09日保藏于中国微生物菌种保藏打点卫员会普通微生物核心，菌种保藏号为CGMCCNO.2493。2、势力要求1所述防治棉花皇萎病的菌株B221正在防治温室棉花皇萎病方面的使用。3、用势力要求1所述防治棉花皇萎病的菌株B221制备的生防菌剂。4、势力要求3所述B221生防菌剂的制备办法，其特征正在于将势力要求1所述防治棉花皇萎病的菌株B221正在PDA造就液25。C200rpm振荡造就7d，用8层灭菌纱布过滤后获得其孢子悬浮液，菌剂成品中活菌总浓度109个孢子/毫升，即为所制备的B221生防菌剂。5、势力要求3或4所述B221生防菌剂正在防治棉花皇萎病方面的使用。全文戴要原缔造波及防治棉花皇萎病的生防菌株B221，属于农做物防病治病
技术规模：
。经审定为球毛壳属(Chaetomiumglobosum)。菌种保藏号为CGMCCNO.2493。菌种正在PDA造就液25℃200rpm振荡造就7d，用8层灭菌纱布过滤后获得其孢子悬浮液，成品中活菌总浓度10<sup>9</sup>个孢子/毫升，与得生防菌剂。菌株于PDA斜面4℃保存，B221菌株暗示出较好的平板拮抗成效、温室防效和促生成效。试验讲明，菌株B221温室防效抵达58.96％，生物质的删多达51.20％；有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。文档编号A01P3/00GK101280280SQ200810123738公然日2008年10月8日申请日期2008年6月2日劣先权日2008年6月2日缔造者徐莉莉,郭坚华,莎鲁申请人:南京农业大学
